细胞培养基对最终制剂稳定性的影响

引言

一系列重组单克隆抗体被批准用于癌症、自身免疫疾病和其他疾病的临床治疗。随着越来越多的单克隆抗体被批准上市，为了提升使用便利性，高浓度的制剂越来越受到亲睐。但是较高产品浓度面临着许多新挑战，包括终产品在整个储存过程中的稳定性和溶解性。影响分子稳定性的聚合体形成往往被作为一个关键质量特性，因为它可能增加免疫源性的风险。在药品说明中往往会限定聚合体含量，并在有效期内必须满足这种限定水平。过去的大量研究都集中在下游纯化过程中工艺参数和伴随的化学修饰等对聚合体产生的影响，但很少有工作去研究细胞培养基及工艺对制剂中聚合体产生的影响。本文主要介绍Eli Lilly的科学家在这方面的工作。

在工艺开发过程中，我们通常会在细胞培养收获液、整个纯化过程、产品制剂开发的加速稳定性研究过程中测定聚合体含量。并且分别在细胞培养工艺开发、纯化工艺开发和制剂工艺开发阶段降低聚合体的含量。遗憾的是，细胞培养、纯化和制剂开发试验通常是独立进行的。人们工作的重点通常是降低不同阶段过程中聚合体的含量，并没有意识到细胞培养基的成分不同会对最终制剂的稳定性造成影响。

本文研究人员在使用GS-CHO系统生产单克隆抗体的工艺优化过程中，发现细胞培养基对抗体制剂的聚合体形成有明显的影响。本文分别使用化学成分限定的培养基（版本1）和非化学成分限定的培养基生产IgG4，采用同样的下游工艺，并浓缩置换到同一种制剂中，在25OC进行加速稳定性实验。图1显示在加速稳定性实验中，非化学成分限定的培养基和化学成分限定的培养基中表达的IgG4在制剂中形成聚合体的水平不同。

图 1 非化学成分限定的培养基和化学成分限定培养基（版本1）在制剂稳定加速实验中聚合体变化趋势

实线为非化学成分限定的培养基，虚线为化学成分限定工艺

实验1 建立HRS分析方法进行制剂稳定性预测

HRS(hydroxylamine reactive species)分析是一种基于荧光衍生的羰基含量分析方法，采用AlexaFluor 350 Hydroxylamine探针将抗体标记。然后采用SEC的方法，并通过UV检测器和FLR检测器。计算FLR值与UV值的比例，根据内参值换算成相对HRS值。由于抗体分子上自由的羰基和氨基之间形成共价交联是形成聚体的一种主要途径。所以希望通过HRS分析，能预测高浓度制剂中形成聚体的程度。

将不同培养基和培养工艺生产的mAb1抗体，采用同样的下游纯化工艺纯化后，进行浓缩和置换缓冲液，使样品终浓度为50mg/mL，进行加速稳定性试验。在25ºC避光孵育4周后，用SEC分析聚合体含量。HRS的分析则直接用ProteinA纯化样品，并使用AlexaFluor 350 Hydroxylamine探针与mAb1在25ºC下反应24小时，SEC-HPLC在UV和FLR检测器下对反应物进行定量。

HRS相对值与加速稳定实验4周后聚合体含量的相互关系如下图所示

从图中可以看出，HRS值与加速稳定实验4周后聚体含量变化呈正相关。由于加速稳定实验需要较长时间才能获得结果，可以采用HRS分析的方法来研究培养基对最终制剂稳定性的影响。

实验2  研究半胱氨酸对制剂中聚合体形成的影响

通过比较图1中两种工艺所采用的非化学成分限定的培养基和化学成分限定培养基（版本1），发现其中半胱氨酸浓度差异比较大。半胱氨酸和培养基中其它成分如维生素C等被认为是抗氧化性成分，但是它们与金属离子反应形成促氧化剂，促进金属离子催化ROS的形成。ROS会造成蛋白中氨基酸的羰基化，最终导致聚体的产生。

本文使用细胞株1在5L发酵罐中分别从三个方面研究半胱氨酸对聚合体形成潜在的影响方式：（1）半胱氨酸的浓度（2）细胞消耗半胱氨酸的化学形式（半胱氨酸或胱氨酸），(3)流加补充半胱氨酸或胱氨酸的方式。细胞培养和相关实验见表1。半胱氨酸的最高浓度与化学成分限定培养基（版本1）相当，最低浓度比非化学成分限定培养基中低。实验方法如下表所示

实验结果如下图

与低浓度的半胱氨酸或胱氨酸（1x，三角图标）相比，高浓度半胱氨酸或胱氨酸（3.5x的图标为菱形，2.3x的图标为正方形）会引起更多聚合体形成。流加方式（连续流加的图标为实线，分段流加的图标为虚线）对聚合体的影响不明显。（a）半胱氨酸数据，（b）胱氨酸数据

采用JMP软件对结果进行分析

细胞培养过程中半胱氨酸对制剂中聚合体形成有明显的影响

以上结果显示了加速稳定性实验中，不同半胱氨酸浓度和形式、不同流加方式（分段/连续）对聚合体形成的影响。半胱氨酸或胱氨酸的浓度与形成聚合体的比例呈反比，更低浓度的半胱氨酸或胱氨酸会降低最终制剂中聚体的含量。胱氨酸与半胱氨酸相比，胱氨酸能降低最终制剂中聚体的形成。因为两个半胱氨酸通过二硫键连接形成胱氨酸，胱氨酸具有较低的氧化还原力，降低了与金属进行促氧化反应的可能，最终降低了聚合体的形成。但是胱氨酸溶解度极低，限制了它在高浓度流加培养基中的应用。流加的方式（分段或连续）与最终制剂中聚体的形成并无明显的关系。

实验3 研究柠檬酸铵铁对聚合体形成的影响

金属离子对芬顿反应（催化类似羟自由基方式的非常激烈的离子反应）和细胞培养中的ROS的产生起着关键作用。在研究半胱氨酸对最终聚体形成的影响之后，也对培养基中铁浓度和聚体形成之间的关系进行了研究。

在揺瓶中分别用版本1的化学成分限定培养基、含有较低浓度柠檬酸铵铁(FAC)的新开发的化学成分限定培养基培养表达mAb2、mAb3、mAb4和BS1（双特异性抗体）的细胞株，通过降低柠檬酸铵铁的浓度进行影响聚合体形成的研究。根据前面的实验结果，新开发的化学限定培养工艺降低了半胱氨酸浓度、添加了一些营养物质阻止培养过程中关键氨基酸的耗尽和改进了浓缩流加培养基的溶解度。所有的实验在14天结束培养，用Protein A亲合层析定量和Protein A填料进行纯化，纯化后的样品用HRS实验预测聚合体形成的趋势。

减少柠檬酸铵铁（FAC）提高产品稳定性

从上表可以看出，四株细胞在化学成分限定培养工艺（版本1）、低半胱氨酸和低柠檬酸铵铁的改进培养基、低半胱氨酸的改进培养基中产量基本一致，甚至在改进培养工艺中产量有一些增高。正如预测的，降低柠檬酸铵铁的浓度会使HRS值减小。确定在化学成分限定培养基和流加培养基中降低柠檬酸铵铁，优化成化学成分限定培养基和流加培养基（版本2）。同时这个实验进一步证实之前mAb1的实验结果，半胱氨酸的浓度降低与多种抗体甚至双特异性抗体的聚合体的减少相关。

实验4 研究化学成分限定培养基（版本2）对产品稳定性影响

在5L发酵罐中分别用版本1化学成分限定培养基、版本2化学成分限定培养基培养表达mAb2、mAb3、mAb4、BS1的细胞株，研究版本2化学成分限定培养工艺对聚合体形成的影响。根据前面的实验结果，版本2化学成分限定培养工艺降低了半胱氨酸和柠檬酸铵铁的浓度。

所有的实验在14天结束培养，用Protein A亲合层析定量和Protein A填料进行纯化，Protein A纯化后的样品用HRS实验、SEC、还原和非还原CE-SDS进行质量分析。样品经protein A纯化后，低pH值处理后使杂质沉淀，深层过滤去除杂质。澄清后的mAb2、mAb3、mAb4用CEX进行进一步纯化，BS1用HIC进行进一步纯化。将样品进行浓缩和置换缓冲液，样品终浓度为100mg/mL。在25ºC避光孵育12周，实验前每个样品和每个检测点的样品用SEC分析聚合体含量。

在化学成分限定培养基（版本1和版本2）中细胞的活细胞生长密度。黑线菱形实心图标代表版本1培养基，绿线三角实心图标代表版本2培养基，空心图标代表平行条件。（a）mAb2，（b）mAb3，（c）mAb4，（d）BS1。

从上图可以看出，细胞在版本2培养基中活细胞密度更高，尤其是在后半段培养期。这使得有三种抗体的产量都得到了提升，如下表。同时与之前的实验结果一致，版本2培养基的HRS值普遍降低。但不同抗体的HRS值并不相同，说明细胞本身和蛋白性质也会影响HRS值，并最终影响制剂中稳定性。

下表显示了经Protein A纯化后的样品进行SEC聚合体分析的结果，所有细胞株在版本2培养基中的聚合体形成较低。同时也显示纯化后样品浓缩前和浓缩后聚合体含量的比较。对所有培养工艺来说，浓缩后聚合体的含量都会增高。但聚合体增高程度取决于分子类型，细胞系，培养条件和最终浓度。

版本2化学成分限定培养工艺提高产品稳定性

将产品置于25ºC进行12周加速稳定性实验作为预测产品在保质期内聚合体形成的模型。

细胞在不同化学成分限定培养基中培养后，最终制剂中聚合体含量变化的SEC值。黑线菱形图标代表版本1培养基，绿色三角图标代表版本2培养基。（a）mAb2，（b）mAb3，（c）mAb4，（d）BS1

从上图可以看出，版本2细胞培养基明显提升了最终制剂中抗体的稳定性，降低了聚体发生的程度。

将本次实验的最终SEC结果和HRS分析结果作图也可以发现他们的线性关系，证明四种分子的HRS值都与聚合体形成呈正相关。

基于版本2培养基的抗体12周加速稳定性实验后聚合体含量与HRS值的相互关系。两者的线性回归方程为y=0.71x，R2=0.95。正方图标代表mAb2数据，三角图标代表mAb3数据，圆形图标代表mAb4数据，菱形图标代表BS1数据。每个数据点代表不同发酵罐生产的产品的加速稳定性实验数据。

讨论

细胞培养基做为整个生物制造工艺过程中最重要的原料，不仅对细胞生长，目的蛋白产量有很大影响，同时对蛋白质量也影响巨大。之前有研究报道过细胞培养基对最终制剂颜色的影响，但并没有涉及到培养基对最终制剂的稳定性研究。本文首次研究了细胞培养基对最终制剂稳定性的影响，并建立了HRS分析方法对最终制剂中聚合体形成趋势进行预测。

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